前言

呼吸道细菌，如肺炎支原体、流感嗜血杆菌、衣原体肺炎和肺炎链球菌，是引起肺炎的人类病原菌。2017年，256万人死于肺炎，是5岁以下儿童的主要死因。因为呼吸道疾病的症状相似，所以需要一种快速准确的护理点试验(POCT)方法来识别病原体，以避免不必要的抗生素治疗。基于聚合酶链反应(PCR)的分子诊断是一种临床公认的技术，在疾病的最终诊断中表现出高敏感性和特异性。然而，传统的聚合酶链反应系统需要耗时的热循环过程来将靶基因扩增到可检测的水平。虽然已经开发了几种等温基因扩增方法，用于在恒温下快速扩增(通常在30分钟内)，但为了进一步应用，需要解决有问题的假阳性反应、引物设计的复杂性、长靶基因的低效率和昂贵的酶。基于免疫测定的POCT平台，如侧流检测试剂盒，是快速诊断传染病的最流行方法，但与聚合酶链反应方法相比，其相对较低的灵敏度和特异性应得到改善，以实现精确诊断。因此，传统的聚合酶链反应方法仍然被认为是一种可靠的诊断方法，这些方法用于明确的诊断，特别是传染病。最近，用于概念验证应用的各种便携式聚合酶链反应系统已经商业化，用于在现场进行快速和早期诊断，以防止社区感染。

研究内容

韩国材料科学研究所的研究人员制备了由堆叠在玻璃纤维滤纸(GFFP)上的银纳米粒子组成的纸基SERS基底。EvaGreen染料是一种插入分子，作为拉曼报告剂引入SERS检测细菌。使用聚合酶链反应仪器进行选择性目标细菌基因扩增，但热循环被最小化，以将该方法开发为快速分子诊断系统。在方案1中示意性地描述了DNA检测的原理。扩增的和未扩增的DNA中的EvaGreen染料结合的差异改变了EvaGreen在SERS底物上的粘附量，并且拉曼强度根据扩增的基因的量而改变。一种人致病性肺炎支原体(M. Pne)被选为用于传感展示的靶基因。在各种热循环和目标基因浓度下，将聚合酶链反应耦合SERS分析与基于荧光的逆转录聚合酶链反应进行比较后，以高分辨率和灵敏度为SERS分析优化了最小基因扩增循环。制备了阵列图案化的银纳米带衬底，并将其集成为用于POCT应用的快速试剂盒原型。为了确定目标基因的存在，将测试线的拉曼信号强度与阳性对照(确认基因扩增的线)和阴性对照(拉曼强度比较的标准线)进行比较(方案1)。目标和非目标基因的统计分析(流感嗜血杆菌；H. Inf)试验证实，所开发的DNA检测方法在10个循环的浓度为3.12 pg/μL时对DNA检测是敏感的。使用原型的总分析时间为30分钟，包括20分钟的热放大和10分钟的SERS测量。

实验方法

为了进行SERS检测，将8 μL在SYBR Green上扩增的目标基因与2 μL最终浓度为3.75 μM的EvaGreen染料混合。将混合溶液(10 μL)滴到纸基SERS基底上，并在60℃的热板上干燥10分钟。在1秒的曝光时间、0.5毫瓦的激光功率和633纳米的波长下测量拉曼信号。从基底的10个随机位置获得拉曼光谱，并取平均值用于绘图。拉曼测量重复三次(n = 3)。在滴加1uM Rhod B和DNA/ EvaGreen混合物(3.12皮克/微升，10个循环)后，从5个不同批次制备的基底的100个随机位置测量拉曼信号，然后测试AgNWs基底的批次间再现性。

使用纸基SERS底物的呼吸道细菌DNA诊断过程示意图。

拉曼光谱用于(a)各种浓度的Rhod B的检出限测试和(b)其标准曲线，(c)各种浓度的EvaGreen染料的拉曼光谱和(d)其标准曲线。

肺炎支原体基因扩增的逆转录聚合酶链反应数据。

EvaGreen/扩增DNA混合物的SERS分析。

结论

研究人员设计了一种快速、灵敏的检测呼吸道细菌DNA的聚合酶链反应-SERS技术。制备了一种由银纳米粒子组成的纸基SERS基底，并根据扩增的脱氧核糖核酸与银纳米粒子表面不同的EvaGreen染料粘附原理，分析了不同基因扩增条件下拉曼强度的变化。与逆转录聚合酶链反应方法相比，基于SERS的分析在最低热循环和基因浓度下的信号强度分辨率显著更高。在优化基于SERS的分析之后，制备的SERS底物被开发为用于细菌DNA诊断的快速试剂盒。通过使用开发的快速试剂盒原型对M. Pne靶基因和非靶基因检测的比较结果，明确诊断出传染性呼吸道细菌基因的存在。基于这些结果，通过改变或扩展感兴趣目标的引物，开发的DNA检测系统有望用于各种POCT分子诊断。

https://doi.org/10.1016/j.snb.2020.128802。