前言

蛋白质是生物体中最重要的生物大分子，在几乎所有的生理过程中都发挥着不同的生物功能。蛋白质的异常表达通常与人类疾病有关，因此已成为临床诊断中广泛使用的生物标志物。目前，依赖于使用表面附着和酶标记抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)是最成熟的蛋白质生物标记检测模型之一，但它总是因识别元件抗体的固有缺点而受到批评，包括高成本、强免疫原性以及差的化学和热稳定性。作为替代方案，适体是一种人工单链核酸(短DNA或RNA序列)，通过指数富集配体系统进化(SELEX)的定义程序产生，并特别结合到从小分子到蛋白质的不同目标分子。核酸配体显示出与抗体相当的结合亲和力和特异性，并显示出优于抗体的几个独特优势，如更高的稳定性、更低的免疫原性以及易于用于化学合成和修饰。

研究内容

上海大学的研究人员利用温和还原提出了一种新的用于蛋白质生物标记物检测的夹心电化学适体感应方法，该方法避免了对适体对的需要。在他们的设计中，目标蛋白被表面固定的适体捕获，并在温和还原后暴露出活性巯基。然后，马来酰亚胺功能化的探针DNA通过马来酰亚胺和活性巯基之间的迈克尔加成连接到蛋白质上，从而形成可用于信号输出的三明治结构。此外，考虑到探针DNA的序列是自由设计的，基于DNA的扩增策略可以容易地结合到该方法中，从而进一步提高检测灵敏度。这里以杂交链式反应为例，它可以积累信号分子，最终引起放大的电化学反应。结果表明，即使在复杂的血清样品中，以甲胎蛋白为模型，他们的方法的灵敏度和特异性也有所提高，并以甲胎蛋白和高尔基蛋白73为例，揭示了方法的多功能性。该方法可能为构建夹心免疫检测方法铺平了一条可行的道路，这将为将来高通量检测疾病相关蛋白生物标志物提供新的思路。

实验方法

目标蛋白首先用ddH2O或1毫米TCEP在37℃处理30分钟，然后用30 KD的超滤器过滤至少三次以除去过量的TCEP。之后，Ellman的试剂被用来测定蛋白质中游离巯基的数量。为此，将250微升经或未经TCEP处理的蛋白质溶液加入到含有2.5毫升反应缓冲液(含1毫摩尔乙二胺四乙酸的0.1微升磷酸钠，pH 8.0)和50微升埃尔曼试剂溶液(1毫升反应缓冲液中含4毫克二硝基甲苯)的制备混合物中。然后将混合物在室温下孵育15分钟，用可见分光光度计在412纳米的波长下测量吸光度。

用于检测蛋白质生物标记物的温和还原促进的夹心亲和方法的原理示意图。

TCEP处理前后表面固定化核酸适体的CC表征。

添加不同浓度甲胎蛋白的DPV效应。

GP73存在下抗GP73适体功能化锗的电化学阻抗谱表征。

结论

研究人员在此提出了一种检测蛋白质生物标记物的夹心电化学适配检测方法，该方法显示了几个优异的特征。首先，该方法构建三明治结构，避免了寻找或筛选适体对的麻烦。其次，由于对探针DNA的序列没有特殊要求，该方法可以很容易地与各种基于DNA的扩增策略结合(如本工作中的HCR)，并具有高灵敏度检测的高潜力。第三，鉴于蛋白质中二硫键的普遍存在，该方法将具有广泛的应用前景。该方法以甲胎蛋白为模型，对甲胎蛋白的电化学检测表现出令人满意的灵敏度和特异性，即使在复杂的血清样品中也能准确区分目标蛋白。以甲胎蛋白和GP73为例的交叉反应性实验不仅证实了该方法的高选择性，而且表明了其通用性，这可以通过改变相应的适体来实现。由于这些特点，该方法有望为基于核酸适体的蛋白质检测开辟一条简单而通用的途径，在临床上蛋白质生物标志物的高通量分析中显示出巨大的潜力。当然，该方法仍然存在一些固有的局限性。例如，该方法不能适用于所有种类的蛋白质，因为一些蛋白质很少或甚至没有二硫键，这将导致温和还原促进三明治结构形成的失败。

https://doi.org/10.1016/j.snb.2020.128762。