淋巴细胞（B，T和自然杀伤细胞）和免疫球蛋白对于针对外部病原体的适应性免疫反应至关重要。 流式细胞仪和酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒是检测免疫球蛋白，B细胞和T细胞的金标准，而阻抗测量是天然杀伤细胞最常用的技术。对于即时，快速且低成本的设备，生物传感器可能适用于可靠，稳定和可重现的免疫球蛋白和淋巴细胞检测。  在文献中，此类生物传感器通常使用抗体，适体，蛋白质和纳米材料制造，而电化学，光学和压电技术则用于检测。这篇论文描述了如何使用这些测量技术和传感器来制造用于检测淋巴细胞和免疫球蛋白总含量的生物传感器。

 论文以题为“     Biosensors for Detecting Lymphocytes and Immunoglobulins    ”与北京时间2020年10月27号发表在《     Biosensors    》上。

 人体的适应性免疫反应取决于对外部抗原（例如病毒，细菌和真菌）起反应的淋巴细胞的作用。 淋巴细胞的数量约为2×10 12，包括B细胞，T细胞和自然杀伤（NK）细胞。  B细胞通过三个阶段开始在骨髓中发育：pro-B，pre-B和未成熟B细胞。每个B细胞都有一个对抗原具有特异性的受体。 另外称为hematogones中，未成熟的B细胞迁移至次级淋巴器官（例如，脾，淋巴结和扁桃体），在那里它们与抗原结合，成为存储器单元和效应细胞。如果相同的外来抗原再次进入人体，记忆细胞将增强并加快免疫系统的反应。效应B细胞产生抗体以阻止抗原扩散。B细胞约占循环淋巴细胞的3–21％。抗体是指B细胞在免疫系统检测到病原体（如病毒）存在时分泌的糖蛋白。抗体也称为免疫球蛋白，分为五个主要类别，即IgG，IgA，IgM，IgE和IgD。IgG在人血清中含量最高（约70％）。的IgG类似于一个“Y”，其中每个臂包括一个重的（约50-70kDa）的基本结构和光（约25kDa）的多肽链由二硫键保持在一起。每条臂都有一个抗原结合片段（Fab）具有恒定和可变氨基酸序列域的区域。可变域包括三个区域，称为互补决定区（CDR）。  重链CDR与轻链CDR的结合形成了互补位，该互补位能够与抗原的位点（表位）结合。改变互补位的长度和序列可以使抗体与大量抗原结合。

 T细胞通过三个阶段开始在胸腺中发育：pro-T，pre-T和未成熟的T细胞。 未成熟的T细胞会迁移至次级淋巴器官，除非它们与诱导凋亡的自身抗原结合。至于B细胞，与抗原结合后，T细胞变成记忆细胞和效应细胞。T细胞是大约循环淋巴细胞的51-88％，并且可被分成两大类，根据CD4的存在+或CD8 +抗原它们的表面。CD4 + T细胞可分为辅助性（T h）和调节性（T reg）T细胞。T细胞通过激活巨噬细胞，B细胞和细胞毒性T细胞（即CD8 + T细胞）和NK细胞来对感染作出反应[ 8 ]。T reg细胞调节T h细胞的活性，以避免不受控制的不良免疫反应。  CD8 + T细胞不仅可以杀死病原体，而且还可以调节自身免疫反应[ 9 ]。CD4 / CD8比率<1与炎症，免疫激活和免疫衰老相关，这会导致发病和死亡的高风险。NK细胞约占循环淋巴细胞的4–29％，无需暴露于抗原即可开始攻击病原体，例如肿瘤和病毒感染的细胞。

 发生相对淋巴细胞减少当绝对总血液淋巴细胞计数<1500 /μL，而计数<1000 /μL与严重的淋巴细胞减少相关联。 淋巴细胞减少症与多种疾病相关，例如免疫缺陷综合症，克罗恩氏病，干燥综合征，胰岛素依赖型糖尿病，骨髓发育不全，肾衰竭和癌症。淋巴细胞增多是条件时，外周血淋巴细胞计数超过约4000-4500 /μL，尽管这个值是8000 /μL幼儿。  与淋巴细胞增多有关的一些疾病是淋巴样恶性肿瘤，肝炎，水痘，结核病，急性血清病，x连锁性淋巴增生性疾病和甲状腺毒症。

 因此，淋巴细胞和免疫球蛋白的检测，定量和表征在临床实践和科学研究中起着基本作用。流式细胞术可能是在临床实验室中对淋巴细胞和免疫球蛋白评估最常用的技术，因为它是相对快速，灵活和敏感的。 然而，流式细胞仪具有一些缺点和局限性，例如缺乏标准化的测定和仪器设置，费力的样品制备以及昂贵的设备和试剂易于使用，便携式且价格合理的即时护理（POC）设备的开发将是淋巴细胞和免疫球蛋白分析的突破。技术，例如酶联免疫吸附测定（ELISA）是目前不适合POC设备或用于与几个专门的实验室用于临床分析。光谱法（例如，拉曼光谱和近红外）和阻抗测量，目前正在测试以制造可靠POC装置。  生物传感器可能是获得紧凑，快速和低成本的设备来检测淋巴细胞和免疫球蛋白的有前途的替代方法。

    电化学生物传感器  

 电化学生物传感器最常用于检测B细胞和免疫球蛋白。在电流型生物传感器中，向工作电极施加恒定电压，然后测量所得的稳态电流。 电流与在工作电极表面氧化或还原的电活性元素的浓度成比例。由于每个电活性元素都具有独特的氧化还原电势，所以安培生物传感器具有很高的选择性。  安培生物传感器可以用于复杂的矩阵中，因此可以成为进行可靠临床分析的有价值的工具。

 一种采用巯基修饰的金底物的安培免疫传感器被用于检测美国锥虫病患者的人血清中的IgG。受体是辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗人IgGγ链（HRP缀合的IgG）。 该传感器可与ELISA相媲美，但由于抗原结合不特异性而具有假阳性。另一个电流型免疫传感器由用于测量IgE的丝网印刷碳电极组成，已知会触发过敏性疾病。在竞争性测定中，磷酸对氨基苯酯酶（p-APP）被用作锚定于抗IgE的介体。尽管在有限数量的血液样本上，结果仍可与ELISA和放射免疫分析相媲美。  研究人员改进了用于IgG的安培免疫传感器的线性范围，制造了三维（3-巯基丙基）-三甲氧基硅烷溶胶-凝胶，以吸收被抗IgG功能化的金纳米颗粒。HRP酶用于阻断抗体和抗原之间的非特异性结合。该免疫传感器在人血清中进行了测试，线性范围为1.12–162 ng / mL，检出限（LOD）为0.56 ng 。

 纳米粒子可以促进电子从蛋白质的氧化还原中心转移到电极表面。 最简单的NP适体传感器是使用适体-金NP共轭物（AuNPs）进行的夹心测定，其中IgE与MB竞争。DPV测量显示LOD为0.52 ng / mL 。研究人员使用方波伏安法（SWV）使用固定在AuNP上的适体检测IgE，并通过富含鸟嘌呤的互补DNA（cDNA G1）放大信号。cDNA G1与适体结合；但是，当适体捕获人IgE时，结合被抑制，并且可以测量IgE的水平（LOD 0.16 pM）。SWV将大幅度方波调制与阶梯波形结合在一起。获得的信号是在正向和反向脉冲结束时测得的电流之间的差。研究人员应用SWV来测量人血清中IgG的浓度。免疫传感器由玻璃碳电极（GCE）覆盖，该电极涂有还原的氧化石墨烯– MWCNT–（钯NPs）纳米复合材料（rGO–MWCNT–Pd），用于固定抗IgG（图1）  。MWCNT避免了rGO的聚集，rGO是一种良好的电导体，并改善了表面积。该免疫传感器的线性范围为0.01–25 ng / mL，LOD为3.3 pg / mL。

 图1. （a）使用还原的氧化石墨烯-多壁碳纳米管-钯NP（rGO-MWCNT-Pd）纳米复合材料制造免疫球蛋白G（IgG）免疫传感器（b）固定在牛血清白蛋白（BSA）稳定的银微球（Ag @ BSA ）上的免疫传感器的制造，获得英国皇家化学学会的许可。（c）在柔性聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）上的金指状电极，用于检测IgG。（d）基于石墨烯的场效应晶体管适体传感器的简化视图。

    光学生物传感器  

 表面等离振子共振（SPR）是电磁波在两种介质的界面处以相反符号介电常数的振荡。SPR是一种用于测量分子在金属表面上的吸附的流行技术，因为等离子波对与金属膜接触的电介质光学特性的变化非常敏感。

 研究人员利用含乙二醇的羧基和羟基封端的SAM功能化金膜，将抗生蛋白链菌素固定在SAM层上后，将适体锚定至抗生蛋白链菌素以检测IgE 。 该生物传感器的LOD约为2 ng / mL，可区分IgE和其他蛋白质，例如IgG和纤维蛋白原。他们制造了一种免疫传感器，其中使用聚（3-氨基苯甲酸）（PABA）固定抗IgG [ 69 ]。该免疫传感器在缓冲液中用SPR进行了测试，其LOD为1 µg / mL。但是，需要重复性测试来评估其性能。Ertürk等人代替抗体和适体。使用了分子印迹抗体片段以检测IgG。这种生物传感器的线性范围为0.02-1 mg / mL，能够检测人血浆中IgG的浓度约为0.6-μg/ mL 。研究人员有效地使用了SPR来测量IgG的浓度。  从鸡卵溶菌酶重组葡萄球菌蛋白A 。蛋白A还用于无标记光子晶体生物传感器中，用于检测IgG；但是，蛋白质A的前景广阔，需要在真实样品中进行验证。

 研究人员开发了一种电化学发光（ECL）适体传感器来检测IgE 。 将CdSe / ZnS量子点（QDs）用MoS 2（金属二卤化金属）官能化，并将酶诱导的HRP生物催化沉淀（BCP）用于信号猝灭。将适体固定在涂有MoS 2 QD的玻璃碳电极上。使用结合至复合AuNPs-HRP的适体进行竞争性测定。该适体传感器在人血清中进行了测试，与ELISA相比误差小于10％。  另一组测量了异金属簇（Ag 6 Au 6（ethisterone）12）-雌激素受体α（Ag 6 Au 6Eth-ERα），使用氧化石墨烯（GO）作为淬灭剂。用IgG恢复PL，因此可以在缓冲溶液中对其进行测量。

 光纤经常被用作生物传感器，因为它们价格低廉，具有出色的光传输，较长的相互作用长度并且可以捕获目标分析物发出的光。通常，光纤具有功能化的末端以检测目标分析物。 对于IgG的检测，Wang等。通过共价结合功能将具有葡萄球菌蛋白A和山羊抗人IgG的光纤功能化。用Mach-Zender干涉仪可以在PBS中以47 ng / mL的LOD检测IgG。  另一个生物传感器提出了一种D型纤维，该纤维在固定抗人IgG之前先用聚二甲基二烯丙基氯化铵（PDDA）和聚对苯乙烯磺酸钠（PSS）功能化（图2a ）。该光纤在缓冲溶液中测试，对明胶，马IgG和猪IgG具有良好的特异性。

 图2. （a）用聚二甲基二烯丙基氯化铵（PDDA）和聚对苯乙烯磺酸钠（PSS）功能化的光学D型光纤免疫传感器，以固定山羊抗人IgG（GaHIgG）来检测人IgG（HIgG） ）。（b）SiO 2 / ZnO纳米线的顶部和侧面SEM图像。

    电化学生物传感器  

 CD4和CD3受体仅由CD4 +淋巴细胞同时表达，而单核细胞和巨噬细胞仅表达CD4受体。 Carinelli等。利用抗CD3抗体修饰的商业磁性颗粒从单核细胞和巨噬细胞中分离CD4 +细胞。用抗生蛋白链菌素-HRP标记的生物素化抗CD4抗体用于标记分离的CD4 +细胞。H2O2和对苯二酚用于进行安培检测（图3a）。  研究人员发现两步式氧等离子体可以提高SWCNT免疫传感器对CD4 +的性能淋巴细胞。第一次等离子体处理从制造过程中清除了纳米管，而第二次处理则产生了羧基，从而改善了抗体的固定性。

 图3. （a）磁致生物传感器的示意图，其中商业磁性颗粒经过抗CD3抗体修饰以从单核细胞和巨噬细胞中分离出CD4 +细胞。用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）标记的生物素化抗CD4抗体用于标记分离的CD4 +细胞。安培测量是由H2O2和对苯二酚进行调节的。（b）以12×5 mm 2的尺寸附着在晶体管栅极顶部的细胞毒性T细胞的例子。（c）无标记的表面等离振子共振（SPR）生物传感器用于分析肿瘤特异性CD8 +细胞的示意图。SPR传感器的金层涂有平面脂质双层，以将主要组织相容性复合物固定在与CD8 +细胞（TCR，T细胞受体）结合的抗原衍生肽（p / MHC）上（在[ 102 ]的允许下进行了改编，版权所有2018美国化学会）。（d）Fe和Au多层交替的条形码纳米线捕获CD8 +的示意图细胞及其分泌的干扰素-γ（IFN-γ）。铁片段用11-氨基十一酸处理以结合抗CD8，而硫醇化的抗IFN-γ抗体缀合到Au片段。

    结论  

 用于监测免疫球蛋白或淋巴细胞的生物传感器的开发具有挑战性。尽管有一些工作达到了合适的临床检测范围，但用于检测免疫球蛋白的阻抗式和FET生物传感器还不够成熟，无法在临床实践中进行测试。 二维材料的不断研究可以提高FET的性能。尽管FET技术在电子设备的制造中得到了很好的整合，但是FET设备在生物传感应用中仍然缺乏稳定性和可重复性。可以克服这些限制，从而改善2D材料的电响应并更新协议以避免非特异性结合。用于免疫球蛋白的光学生物传感器主要基于SPR检测。  但是，几乎所有它们都只能在缓冲溶液中使用。压电生物传感器可以与基于伏安法的技术竞争，并提出QCM作为现有实验室技术的有效替代品。 在复杂的基质中，基于伏安法的技术可提供最佳响应，但尚不清楚抗体或适体是否是免疫球蛋白传感器的最合适受体。与抗体相比，适体具有多个优点，例如更长的保质期，更低的生产成本，高的批次间可重复性和可逆的热变性。  但是，适体在体内或暴露于核酸酶时具有短的半衰期，除非经过化学修饰。压电生物传感器可以与基于伏安法的技术竞争，并提出QCM作为现有实验室技术的有效替代品。在复杂的矩阵中，基于伏安法的技术可提供最佳响应，但尚不清楚抗体或适体是否是免疫球蛋白传感器的最合适受体。 与抗体相比，适体具有多个优点，例如更长的保存期限，更低的生产成本，高的批次间可重复性和可逆的热变性。但是，适体在体内或暴露于核酸酶时具有短的半衰期，除非经过化学修饰。压电生物传感器可以与基于伏安法的技术竞争，并提出QCM作为现有实验室技术的有效替代品。在复杂的基质中，基于伏安法的技术可提供最佳响应，但尚不清楚抗体或适体是否是免疫球蛋白传感器的最合适受体。与抗体相比，适体具有多个优点，例如更长的保质期，更低的生产成本，高的批次间可重复性和可逆的热变性。但是，适体在体内或暴露于核酸酶时具有短的半衰期，除非经过化学修饰。但尚不清楚抗体或适体是否是免疫球蛋白传感器的最合适受体。  与抗体相比，适体具有多个优点，例如更长的保质期，更低的生产成本，高的批次间可重复性和可逆的热变性。但是，适体在体内或暴露于核酸酶时具有短的半衰期，除非经过化学修饰。但尚不清楚抗体或适体是否是免疫球蛋白传感器的最合适受体。 与抗体相比，适体具有多个优点，例如更长的保质期，更低的生产成本，高的批次间可重复性和可逆的热变性。