片上器官（OoC）通常称为微生理系统（MPS），是先进的体外工具，能够复制人体器官的基本功能。由于它们具有空前的概括天然细胞环境关键特征的能力，它们代表了组织工程和药物筛选应用中的有前途的工具。  在OoC中实现适当的功能至关重要。为此，需要评估几个参数（例如，化学的，物理的）。当前，大多数方法依赖于片外分析和成像技术。然而，对组织结构的连续，无创和实时监测的迫切需求要求直接集成生物传感器。  研究人员关注于将生物传感系统小型化并嵌入到芯片上器官平台中。

 相关论文以题为“     Integrating Biosensors in Organs-on-Chip Devices: A Perspective on Current Strategies to Monitor Microphysiological Systems    ”与北京时间2020年08月28号发表在《     Biosensors    》上。

 能够复制人体器官和组织的结构和功能的微工程体外模型的开发有望促进药物开发领域的发展。这些模型是有前途的工具，用于阐明生物学机制基本形态发生和致病过程，以及用于研究，其是最重要的用于药物筛选过程[改善细胞机制。

 培养皿或类似标准培养平台上的二维（2D）细胞培养通常用于药物研究和开发，因为它们具有多种优势，例如简单，低成本和易于操作。 然而，在静态培养中，要获得特定的细胞表型并在体内细胞与细胞以及细胞与细胞外基质（ECM）之间繁殖，相互作用是具有挑战性的。最近，引入球体技术来开发类器官，即从多能干细胞或分离的器官祖细胞衍生的体外组织模型，这些组织分化为多种细胞类型并以类似于体内的方式自我组织。因此，类固醇可以在三维（3D）构造中共培养多种细胞类型，并在体外重建更多生理相关的设置，但是它们显示出一些缺点，例如成本相对较高，缺乏可重复性和标准化方案，因为以及不存在血管的形成和坏死核。在这种情况下，正在研究片上器官OoC（也称为微生理系统，MPS）作为标准体外工具和潜在动物模型的替代方法。OoC是微型化的体外模型，建立在先进的2D和3D人细胞培养物上，可复制特定的组织结构，支持细胞活力和器官功能。OOC已被证明能够更好地预测人类特有的临床疗效比目前临床前模型。这些平台还提供了多种从小型化，包括快速和廉价的制造技术，设计灵活性遗传优势，以及作为试剂的消费量减少而珍贵的细胞（例如，患者的特定细胞和诱导的多能干细胞）。  因此光正交码的提高增加的预期有希望的工具疾病建模，药物测试和个性化医疗。

    用于测量OoC代谢活性的生物传感器  

 体外OoC系统中功能组织形成的主要决定因素是细胞培养环境，在该环境中，细胞暴露于氧气（O2）水平，pH，营养成分以及分泌的代谢产物（例如，葡萄糖和乳酸）的梯度变化中）。将分析型生物传感器集成到OoC平台可实现可控和可重现的细胞培养环境。具体来说，已经集成了不同的微传感器来监测培养细胞的代谢活性。

 氧气监测似乎与肝脏和肠道应用特别相关。在天然肝脏中，沿着肝脏正弦曲线形成的氧梯度会引起功能划分，称为代谢区划，这直接影响肝细胞的营养代谢，形态和异源生物转化。 Bavli等人开发了一种基于聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）生物反应器的片上肝脏，其中可以在生理条件下（2μL/ min）灌注聚二甲基硅氧烷（PDMS）微孔插入物来模拟这种肝脏分区。特别是，他们将HepG2 / C3A细胞球体与能够实时监测线粒体呼吸的探针一起培养了28天。具体而言，这些探针由直径为50μm的聚苯乙烯微珠组成，这些微珠负载有钌基磷光染料，磷光衰减时间随氧浓度的变化而降低。为了评估这种光学氧气传感器的功能，他们用鱼藤酮（1、50和200 µM）挑战了球体，鱼藤酮是一种已知可在低浓度下诱导细胞凋亡的有机农药和曲格列酮（50-2000 µM），一种抗炎药，由于严重的药物诱导的肝毒性而从市场上撤出。对于这两种化合物，氧吸收在剂量依赖性细胞损伤后迅速下降。  在另一项研究中，Moya等人开发了一种模块化生物反应器（ExoLiver，图1a）由上微流体腔和下静态腔组成，用于培养原代人肝细胞（PHH）。这两个腔室之间用聚四氟乙烯（PTFE）膜隔开，该膜内嵌有三个喷墨印刷的电化学安培式氧气传感器，以同时监视流入（中流），中间和流出（蠕动）的氧气水平肝培养室，并概述肝区带。

 关于片上肠道系统，建立和维持氧梯度对于同时允许分别在有氧和无氧条件下培养肠上皮细胞和微生物组至关重要。 事实上，许多细菌在失败的氧浓度是，与此相反，需要用于肠细胞维持大于0.5％。为了模仿这种情况，Shah等人在模块化微流控设备中培养的Caco-2细胞和厌氧菌（HuMiX，图1b）由三个微腔组成：一个用于中等灌注，一个用于人类上皮细胞培养，最后一个用于微生物培养。微孔可渗透膜将灌注和上皮微腔分隔开，而纳米孔膜将上皮和微生物微腔分隔开。光学氧气传感器（灵敏度为0.03％O 2，直径为5 mm）固定在上部和下部外壳上，与灌注和微生物微腔的入口和出口相邻20 mm。同时灌注有氧（21％溶解的O 2）和缺氧（0.1％O 2））分别通过灌注微腔和微生物微腔的培养基可以建立和维持代表体内情况的氧气梯度。Jalili-Firoozinezhad等人也采用了光学氧传感器来实时无创，无细胞毒性地监测芯片上肠道设备中的溶解氧浓度。特别是，他们开发了一种多层微流体装置，该装置包括上部和下部细胞培养微通道，并在其间夹有微细加工的多孔弹性膜。在顶部上皮通道和底部内皮通道的入口，中间和出口处嵌入了六个包含氧猝灭的荧光颗粒的传感器点，以监测氧的张力。由于该设备由高透气性PDMS组成，因此传感器对氧气浓度的变化做出快速响应（<30 s）。为了同时提供足够的氧气水平以维持人体细胞和适合培养复杂人体微生物的厌氧微环境，同时建立功能性的宿主-微生物组界面，他们用5％的湿润CO 2连续冲洗上腔室。在氮气（N2）中。  这种设置使得能够产生生理上相关的厌氧条件，从而维持上腔腔内的低氧水平（<0.5％），而上皮是通过氧气从可渗透的PDMS膜通过流经下层的氧化介质扩散而得以维持的内皮通道。

 图1. （a）组成ExoLiver的隔室示意图（i）；生物反应器的横截面，显示了三个传感器的位置（ii）；具有所有流体和电气连接的ExoLiver的真实图片（iii）。（b）HuMiX设备的分解代表性视图（ii）：夹在两个装有光学氧气传感器的聚碳酸酯外壳之间的弹性垫片（厚度：700μm）；每个垫圈都定义了一个独特的螺旋形微通道（长度为200毫米，宽度为4毫米，高度为0.5毫米）；使用微孔膜（孔径为1μm）允许扩散至人细胞的灌注，用于分隔灌注和人微腔，而纳米孔膜（孔径为50 nm）将人和微生物微腔分隔为防止微生物渗入人体微腔（i）；与鼠李糖乳杆菌共培养24小时后，从HuMiX设备中提取的洗脱液GG（LGG）（ii）；与LGG共培养开始后，灌注和微生物微腔室内的氧气浓度分布。红点表示微生物微腔（iii）中的接种前氧气浓度为2.6％。（c）硫醇-烯-环氧生物芯片的氧生物传感原理（一）；5μm氧传感器微粒附着在硫醇-烯-环氧生物芯片的反应性聚合物表面上；调节（ii）微通道体积分别为1.4μL（h = 45μm），2.8μL（h = 90μm），7.6μL（h = 250μm），15μL（h）的硫醇-烯-环氧生物芯片的除氧能力= 500μm）和30μL（h = 750μm），（iii）流速在0-20μL/ min范围内，（iv）固化温度在22-130°C（h = 90μm）范围内），以及（v）固化时间为7分钟至6小时（h = 90μm，150°C固化温度）。

 在OoC系统中重建厌氧培养环境在疾病建模中也很重要。 例如，Mauleon等人开发了一种微流体充氧设备，该设备能够快速精确地调整小鼠脑片亚区域的空间充氧条件，以模仿中风事件。特别是，他们采用了基于钌的光学氧传感器，以在诱导低氧损伤后监测脑片中的O2含量。实际上，短时5分钟的缺氧刺激会对神经元细胞产生持久性损伤。他们能够创造一个低氧环境（9％O2）在不到4分钟的时间内覆盖整个切片，并且切片的底部到顶部（厚度为350 µm）仅相差8％。同样，Sticker等人生成了低氧条件下的血脑屏障（BBB）模型，以模拟急性缺血性中风情况。在他们的研究中，开发了一种基于硫醇-烯-环氧化学的微流体装置，因为这种材料具有固有的除氧性能，可调节氧浓度。他们采用了两种互补的氧传感策略：附着在设备表面的5 µm钯基光学氧敏感微粒和电化学氧传感方法，可通过电极表面的氧化直接检测溶解的氧含量。两种传感器系统均用于通过修改硫醇-烯-环氧生物芯片的几何特征和制造参数来评估材料调节设备中氧水平的能力（图1c）。  特别是，在生物芯片制造过程中，可以很容易地在所施加的固化温度上调节除氧速率，以从设备中除去氧气，而无需外部孵育室或可溶性化学除氧剂。

 总而言之，检测细胞培养基中溶解氧的浓度对于监测各种OoC应用中的细胞培养条件至关重要，因为器官特异性培养条件的改变或强烈变化可能会导致意想不到的细胞应激和损害。

    葡萄糖和乳酸  

 葡萄糖是细胞的主要能源，在有氧或无氧条件下，葡萄糖分别代谢为丙酮酸或乳酸。 特别地，乳酸浓度的增加被认为是细胞应激和功能障碍的指示。因此，监测葡萄糖和乳酸的浓度是很重要的，不仅来衡量0℃的设置的可靠性，而且还提供有关细胞的健康和功能，在毒性细胞生存力，癌细胞发展的分子基础脑功能，细胞代谢和线粒体功能障碍的动态变化（即从氧化磷酸化到厌氧糖酵解）。

 近年来，各种类型的葡萄糖和乳酸传感器已经被开发用于集成到0℃和平台。电化学生物传感器主导了基于酶的生物传感器领域。 在这些生物传感器中，特定的酶（即葡萄糖或乳酸氧化酶）作为生物识别元件被掺入并固定在直接置于传感电极（通常是铂）上的膜（例如，基于聚（甲基丙烯酸2-羟乙酯）（pHEMA））上电极）。一旦此类固定化酶催化相应的分析物（即葡萄糖或乳酸盐），则过氧化氢（H2O2）是通过伏安法或安培法生产和测量的，与目标分析物的浓度直接相关。与光学测量相比，这种电化学传感方式是优选的，因为它们易于集成在微流体设备中，但是需要频繁的重新校准，并且常常受到传感器寿命的限制。为了克服后者的局限性，Misun等人设计了带有可互换传感器的混合微流体平台。  他们开发了带有可移动传感器模块的悬挂式PDMS设备，用于3D结肠微组织的形成，培养和同时就地监测葡萄糖和乳酸，在应用不同的培养条件后获得了出色的检测灵敏度。

 电化学生物传感器也已被用于监测药物引起的毒性。 在这方面，Bavli等人开发了一种灌注型聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）生物反应器（图2a），集成了一次性PDMS微孔插入物，用于观察线粒体抑制剂鱼藤酮和抗糖尿病药曲格列酮暴露后肝球体的变化。通过片外电化学传感器单元，他们实现了实时葡萄糖和乳酸测量，显示出给药后乳酸对葡萄糖的比率增加。具体而言，他们证明了在曲格列酮低浓度（50 µM）（低于临床毒性阈值）下，细胞向糖酵解的强烈转变而不会损害细胞活力。在另一篇著作中，Weltin等人开发了电化学葡萄糖和乳酸传感器，用于在化合物剂量下连续原位监测肝和脑细胞的培养条件。特别是，他们采用了临床上用于治疗高血压的波生坦药物，以显示3D HepaRG球体产生的乳酸盐的剂量依赖性降低，而抗霉素A被用作增加肝细胞乳酸盐产生的模型药物（图2b）。  此外，他们制造了用于2D T98G脑癌细胞培养的硼硅酸盐玻璃芯片，并采用了细胞松弛素B来减少在恒定的介质灌注下细胞乳酸的产生。

 图2. （a）肝脏生物反应器组件：底部聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）外壳，盖板玻璃，激光切割的PDMS微孔，玻璃窗和顶部PMMA盖板（i）；组装好的生物反应器的照片（ii）；过夜孵育后，HepG2 / C3A类器官的复合瓷砖扫描图像（iii）；暴露于鱼藤酮后乳酸相对葡萄糖比率的变化（虚线，iv）；暴露于曲格列酮后乳酸相对葡萄糖比率的变化（虚线，v）。（b）放置在96孔细胞培养板中的用于乳酸监测的微传感器设备（i）和在18 h内暴露于30μMAntimycin A的HepaRG球体的乳酸测量（ii）。

    细胞因子和其他代谢物  

 最近，连同基于酶的电化学生物传感器一起，已经投入了大量的精力将电化学免疫传感器整合到OoC平台中。有几种方法，例如伏安法，安培法和阻抗测量已用于开发电化学免疫测定法，目的是使信号和传感器灵敏度最大化。 在线观察细胞分泌的分子对于观察细胞/组织代谢活性的变化至关重要。例如，细胞因子在免疫反应（例如细胞的增殖，迁移或活化）过程中调节着不同的细胞功能，并被证明在癌症进展以及细胞间信号传导中起着至关重要的作用。最广泛使用的用于细胞因子和小分子蛋白原位技术片上检测是基于免疫测定诸如在抗原抗体的测定法，适体为基础的测定，和珠为基础测定法。

 关于将基于抗体的传感器集成到OoC平台中，已经开发了许多功能化策略，以确保将抗体有效且可重现地固定在传感器电极上，以提高检测灵敏度。 例如，Ortega等人开发了基于PDMS的芯片上肌肉平台，用于局部监测鼠骨骼成肌细胞产生的炎性细胞因子白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）。他们的多重电化学传感系统位于培养芯片的出口，它包含抗体功能的安培传感器，其灵敏度在纳克每毫升范围内。  通过电刺激和生物刺激（即脂多糖（LPS）给药）刺激细胞构建体，他们显示骨骼肌分泌这些细胞因子受运动压力的调节。

 由于适体是高度敏感的，选择性的和热化学稳定的，近来对于检测蛋白质和细胞因子而言，适体已优于抗体。 在这方面，Shin等人开发了一种基于适体的电化学生物传感平台，该平台流体连接至生物反应器培养室，以监测对心脏类器官的损害。特别是，他们使用肌酸激酶-MB生物标志物特异性的适体对电极进行功能化，在系统中施用阿霉素后，其浓度以剂量和时间依赖性方式增加（图3）。此外，刘等人通过蒽醌和亚甲基蓝氧化还原报告基因在金电极上标记适体，量化了在微流控装置中培养的活化T细胞产生的炎性细胞因子干扰素（IFN-γ）和TNF-α。靶细胞因子在电极表面的出现导致特定的氧化还原峰以浓度依赖的方式向下移动。同样，Zhou等人开发了一种与基于适体的传感器相集成的微流控设备，用于在酒精损伤（即100 mM乙醇48小时）后连续监测肝细胞和星状细胞共培养中转化生长因子β（TGF-β）信号传导（图3b）。  设计的平台能够监测通过TGF-β传递的两种细胞之间的旁分泌串扰，并指出了肝细胞作为肝损伤早期诱导剂的重要性。

 图3. （a）微流生物反应器和心脏球体的照片（i）；在暴露于不同浓度（0、1和10μM）的阿霉素（ii）后，测量随时间变化的正常化心肌跳动率。（b）基于适配子的两层设备，可监视肝细胞和星状细胞之间的通信分为三个阶段。步骤1：关闭阀以允许细胞接种；步骤2：将100 mM EtOH注入肝细胞腔，以损伤细胞；步骤3：提高屏障，使受伤的肝细胞与静止的星状细胞通讯；步骤4：再次降低中间屏障，以隔离受损肝细胞中的星状细胞，并监测星状细胞中TGF-β1的产生。。（c）用于肝细胞培养和分泌生长因子检测的微流系统；装置的照片和显微图像；红色和绿色食用染料分别注入细胞培养室和传感室。比例尺= 500μm。

    结论  

 OoC平台是功能强大的临床前工具，有望在药物开发过程中有效地减少，提炼并可能替代动物试验，并符合3R（替代，减少和提炼，2010/63 / EU指令）） 原则。 在这方面，OoC系统代表了一种事实解决方案，可以加快新化合物的开发（同时进行功效和安全性筛选），降低试剂和细胞的成本，并通过采用人类细胞，可以更好地预测人类特定的临床结果。但是，OoC进入市场的道路仍然很长，并且部分取决于集成高吞吐量监控系统的能力。正如研究人员所报道的那样，OoC片上监控策略的开发已经取得了许多进展。但是，尽管不同类型的生物传感器可以连续，实时地监测建筑内部环境（例如，氧气和细胞因子的浓度）和物理（例如，心肌细胞的跳动特性），障碍物完整性）参数已被研究并在各种OoC平台中采用，它们的日常应用仍然受到传感器特定缺点的阻碍。如今，光学和电化学生物传感器是实时监测细胞行为（即收缩和新陈代谢）的首选，尽管存在一些局限性，包括低分辨率和由于电极饱和导致的传感器寿命短。与电化学传感器一起，使多个传感器小型化和并行化的可能性使电阻抗光谱法成为实现基于标准化阻抗的OoC平台内完全集成的最直接方法。然而，在这种情况下，主要缺点是数据分析的复杂性和系统的高成本。  事实证明，将MEA集成到OoC中可以记录具有高空间和时间分辨率的神经和心脏电活动，但是大多数MEA仅适用于2D模型，因此限制了监视3D结构的可能性。 最后，TEER测量已被广泛用于量化OoC内部的屏障完整性，但是由于电极位置，温度，培养基成分以及细胞培养时间的不同，它们具有可变性。所有这些因素，再加上由于测量设置而引起的固有变化，使得TEER值之间的比较具有挑战性。因此，需要一种跨学科的方法来改善现有类型的生物传感器，或者开发能够克服所有这些缺点的新型生物传感策略。  但大多数MEA仅适用于2D模型，因此限制了监视3D结构的可能性。最后，TEER测量已被广泛采用以量化OoC内部的屏障完整性，但由于电极位置，温度，培养基成分以及细胞培养时间的不同，它们具有可变性。 所有这些因素，再加上由于测量设置而引起的固有变化，使得TEER值之间的比较具有挑战性。因此，需要一种跨学科的方法来改善现有类型的生物传感器，或者开发能够克服所有这些缺点的新型生物传感策略。但大多数MEA仅适用于2D模型，因此限制了监视3D结构的可能性。最后，TEER测量已被广泛用于量化OoC内部的屏障完整性，但是由于电极位置，温度，培养基成分以及细胞培养时间的不同，它们具有可变性。所有这些因素，再加上由于测量设置而引起的固有变化，使得TEER值之间的比较具有挑战性。因此，需要一种跨学科的方法来改善现有类型的生物传感器，或者开发能够克服所有这些缺点的新型生物传感器策略。但由于电极的位置，温度，培养基成分以及细胞培养时间的不同，它们会受到变化的影响。所有这些因素，再加上由于测量设置而引起的固有变化，使得TEER值之间的比较具有挑战性。  因此，需要一种跨学科的方法来改善现有类型的生物传感器，或者开发能够克服所有这些缺点的新型生物传感器策略。但是由于电极的位置，温度，培养基成分以及细胞培养时间的不同，它们会受到变化的影响。所有这些因素，再加上由于测量设置而引起的固有变化，使得TEER值之间的比较具有挑战性。因此，需要一种跨学科的方法来改善现有类型的生物传感器，或者开发能够克服所有这些缺点的新型生物传感策略。