相信很多人都对生物分子领域感兴趣，不断探索未知领域是我们人类的天性。今天小编要讲的原位杂交技术就是如今由分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，该技术最早始于上个世纪六十年代，经过几十年的发展后，原位杂交技术已经获得了突飞猛进的发展。那么，到底什么是原位杂交技术呢，原位杂交技术检查流程是什么样的，它的目的是什么，有哪些应用？下面兼职馆小编就为您一一道来，为您详细讲解什么是原位杂交技术以及原位杂交技术检查流程、目的、应用。
什么是原位杂交技术？原位杂交技术检查流程、目的、应用一、什么是原位杂交技术1、原位杂交技术发展史原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是由分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。
1969年美国耶鲁大学的Gall等(1969)首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，将该基因进行定位，与此同时Buongiorno—Nardelli和Amaldi等(1970)相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交技术。
自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是20世纪70年代末到80年代初，分子克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，为原位杂交技术的发展奠定了深厚的技术基础。
2、原位杂交技术基本原理原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。
为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物。
RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。
其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交)，所形成的杂交体 (Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交技术 经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已 成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。
什么是原位杂交技术？原位杂交技术检查流程、目的、应用二、原位杂交技术检查流程原位杂交涉及的步骤：玻片的准备和样品固定，细胞或组织的预渗透处理，靶DNA变性（DNA原位杂交），探针制备，原位杂交过程，杂交后洗涤，探针（显色）检测。
1.玻片的准备和样品固定对于染色体涂片，1：1的乙醇/醚处理的载玻片已能符合要求。对于组织切片的原位杂交，为了在实验过程中不丢失组织样品，可使用多聚赖氨酸或铬矾明胶包被的载玻片。
样品的固定步骤是为了保持样品的原有形态学。样品固定是原位杂交中必不可少的步骤，从化学反应角度来看，固定剂的使用和选择对后续杂交的影响不会太大，因为核酸杂交的功能分子基团被安全地包裹在DNA双螺旋结构中，而交联剂的使用对RNA基本没有影响。对于染色体涂片，常使用甲醇/醋酸溶液固定；石蜡包埋的组织切片用福尔马林固定。冷冻切片可通过在4%的甲醛溶液中固定30min，或使用Bouin固定剂。
2.样品预处理在待测样品中，DNA或RNA通常都是被蛋白包裹缠绕，根据不同的细胞和组织样品的应用，可选择合适的预处理方法将靶核酸暴露：内源性酶灭活：如果探针的检测是通过酶促法进行的，则样品内相应的内源性酶必须被灭活。如内源性的POD可通过含1% H2O2的甲醛溶液处理30min。如果检测酶为AP，可在底物溶液中加入左旋咪唑，AP检测的内源性背景一般来说比POD检测的低得多，因为在杂交过程中，样品中内源性AP酶的活性基本都丧失了。
RNase处理：在DNA-DNA杂交实验中，RNase的处理可去除内源性RNA，增加实验的信噪比。在进行mRNA为靶标的检测时，RNase处理的样品也可作为质控对照。通常的处理方式是将DNase-free的RNase溶解于2×SSC (100μg/ml)，样品在溶液中37℃处理60min。
SSC=150mM NaCl, 15mM 柠檬酸钠溶液(pH7.4)
HCl处理：对样本进行20-30min的200mM HCl处理，可将蛋白抽提，并将核酸序列进行一定程度的水解，增加杂交检测的信噪比。
去垢剂处理：如果对样品的固定、脱水、包埋等预处理过程不足以将脂膜成分破坏暴露核酸，可对样品进行额外的蛋白去垢剂处理(如Triton X-100和SDS)。
蛋白酶处理：样品中待杂交的核酸序列常与蛋白缠绕交联在一起，样品的固定步骤更是加剧了蛋白的交联程度，因此预渗透是核酸杂交前的常规步骤，通常通过蛋白酶K的消化作用来完成。根据不同的文献来源，蛋白酶K的工作浓度通常设为10-500μg/ml(溶解于20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7.4, 酶浓度可根据具体样品进一步优化)，对样品进行37°C 7.5 –30 min的处理。染色体涂片或核片的蛋白酶K处理浓度可降至1μg/ml消化7.5 min。也有文献指出，福尔马林固定石蜡包埋的组织切片样品，使用胃蛋白酶（500μg/ml，溶于200mM HCl）将得到较好的蛋白消化结果。
对于结缔组织，肝组织等样品，还可进行Collagenase和Dispase的组织消化处理，以降低背景。
3.探针制备在进行研究前，确定应用的探针类型。不同探针类型的优劣势请见上文描述。DNA探针的制备包括了前期的DNA片段分离纯化（或cDNA的克隆）和酶促探针标记，可选随机引物标记法和缺口平移法等。RNA探针的制备包括了转录载体克隆和转录法探针标记。寡核苷酸探针的制备要求先获得合成的寡核苷酸片段，再进行末端标记或加尾法探针标记。但无论采用何种标记探针及标记方法，对探针标记效果需进行最终的评估，并准确计算探针浓度。
4.原位杂交过程杂交前可进行预杂交，以防止较高的背景染色。预杂交条件与杂交条件相同，只是预杂交液中不含探针和硫酸葡聚糖（见下）。
靶DNA的变性（对mRNA的原位杂交无需此步）
样品DNA的变性在DNA-DNA杂交检测中是必须的步骤，但同时可能会造成样品形态学的部分破坏，此步是实验中需要优化的一个步骤。常用的变性方法为碱变性和热变性，实验时可以摸索变性时间、变性温度等参数以获得最佳条件。
如使用热变性方法，可在杂交时将探针的变性和样品DNA变性同步进行：将样品和探针溶液加盖盖玻片，置于烘箱80℃变性，染色体DNA样品处理2min，后冷却至37℃进行杂交。组织样品DNA的变性时间可增加至80℃10min。
杂交流程杂交液的成分主要影响了核酸杂交的复性动力学和热稳定性。杂交液的基础成分为：Denhardt’s溶液（Ficoll，BSA，PVP），异源核酸（如鲱精子DNA/tRNA/竞争DNA），磷酸钠，EDTA，SDS，盐离子，甲酰胺和硫酸葡聚糖，以及杂交探针。不同的应用中进行杂交温度、pH、盐离子、甲酰胺、探针浓度等条件的优化。常用的pH范围为6.5~7.5，较高的pH值有助于提高杂交的严谨性。
杂交液中的阳离子浓度通过静电排斥作用影响了杂交体之间的链稳定性，较高的盐浓度将增加杂交体的稳定性。大于0.4M的Na离子浓度，对Tm值、双链复性速率的影响不大，但随着Na离子浓度的降低，将显着影响Tm值和双链复性速率。
有机溶剂（甲酰胺）的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等双链体的解链温度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na+ 90~100℃的条件下变性，那么应用于原位杂交，样品必须在65~75℃的条件下进行长时间变性，这将导致样品形态学的破坏。50%甲酰胺的应用能将杂交温度降至30~45℃。
硫酸葡聚糖具有很强的水合性，高浓度的硫酸葡聚糖会使得核酸分子无法获得周边亲水环境，增加了探针浓度，加快杂交反应速率。
杂交常用条件：50% 去离子甲酰胺、2x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.01 mM EDTA、载体DNA/RNA (1 mg/ml)、探针(20 - 200 ng/ml)、1x Denhardt’s、5 - 10%硫酸葡聚糖、+37 to +42°C下杂交5 min - 16 hours对于短链的寡核苷酸探针，具有特殊的杂交动力学和杂交体稳定性，可尝试从以下杂交条件开始优化：25% 去离子甲酰胺、4x SSC、50 mM NaH2PO4 / NaH2PO4 buffer; pH 7.0、1 mM EDTA、载体DNA/RNA (1 mg/ml)、探针(20 - 200 ng/ml)、5x Denhardt’s、+15 to +25°C下杂交2 - 16 hours杂交后的洗涤杂交后进行非特异结合探针的洗脱，同时也可进行单链核酸链的酶消化。洗脱的严谨性可通过调节洗脱液中的甲酰胺浓度、盐浓度和洗脱温度。常规洗涤条件为含50%甲酰胺的2×SSC。但在实际的实验中发现，对于提高杂交检测的特异性，严谨的杂交条件比严谨洗涤更为有效。
5.免疫细胞化学反应(报告分子标记的探针)
如果使用间接检测的方法，通常需引入免疫细胞化学反应进行酶免反应和底物检测。免疫检测前进行样品的封闭能防止检测时的高背景。如进行生物素标记的探针杂交和检测，在含Tween 20 和BSA的PBS中进行封闭。
如进行DIG标记的探针杂交和检测，在含Blocking Reagent的Tris-HCl缓冲液中进行封闭。如果抗原抗体的结合能不受高盐条件影响，检测时加入0.4 M NaCl将有助于防止背景染色。封闭后再进行抗体孵育反应，通常是在保湿容器中进行37°C 30 min孵育(或室温2h孵育)。抗体结合后在含Tween 20的缓冲液中进行3次5–10 min的洗涤。
酶反应显色：使用POD和底物DAB/咪唑构成的显色系统、AP和底物BCIP/NBT构成的显色系统；酶免反应的检测灵敏度提高，成色后色原性物质的稳定性和定位功能更好。另外，AP还有一种用于荧光检测的底物HNPP/Fast Red TR, 用于提高荧光检测的灵敏度。
6.显微镜检测POD和AP的底物显色反应后使用普通的显微镜镜检，且显色可永久保留。该检测手段能满足大部分研究的灵敏度需求。对于样品厚度较高或密度较大的情况，可使用相差显微镜进行镜检。
如使用荧光标记的探针，则在杂交和洗涤步骤后直接用荧光显微镜观察。荧光探针配合荧光显微镜的检测是进行多重探针检测的良好手段，检测时建议使用抗荧光衰减封片剂，以减缓荧光淬灭。DNA复染用的PI或DAPI可直接溶于封片液进行染色(40 ng DAPI/ml; 100 ng PI/ml) 。
三、原位杂交技术目的从上面的内容讲解我们可以很容易知道，原位杂交技术目的就是为了检测或定位某一特定的目的DNA或目的RNA的存在。
四、原位杂交技术应用1、基因组原位杂交技术基因组原位杂交(Genome in situ hybridization，GISH)技术是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。它主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作封阻，在靶染色体上进行原位杂交。GISH技术最初应用于动物方面的研究(Pinkel et al.,1986)，在植物上最早应用于小麦杂种和栽培种的鉴定(余舜武等 2001；王文奎等 2000)。
2、荧光原位杂交技术荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位杂交技术。它利用荧光标记的核酸片段为探针，与染色体上或DNA显微切片上的特异fl-N：~行杂交，通过荧光检测系统(荧光显微镜)检测信号DNA序列在染色体或DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂交位点。FISH技术检测时间短，检测灵敏度高，无污染，已广泛应用于染色体的鉴定、基因定位和异常染色体检测等领域。FISH是原位杂交技术大家族中的一员，因其所用探针被荧光物质标记（间接或直接）而得名，该方法在80年代末 被发明，现已从实验室逐步进入临床诊断领域。 基本原理是荧光标记的核酸探针在变性后与已变性的靶核酸在退火 温度下复性；通过荧光显微镜观察荧光信号可在不改变被分析对象（即维持其原位）的前提下对靶核酸进行分析。
DNA荧光标记探针是其中最常用的一类核酸探针。利用此探针可对组织、细胞或染色体中的DNA进行染色体及基因水平 的分析。荧光标记控针不对环境构成污染，灵敏度能得到保障，可进行多色观察分析，因而可同时使用多个探针，缩 短因单个探针分开使用导致的周期过程和技术障碍。
3、多彩色荧光原位杂交技术什么是原位杂交技术？原位杂交技术检查流程、目的、应用多彩色荧光原位杂交(Multicolor fluorescence in situ hybridization，mFISH)是在荧光原位杂交技术的基础上发展起来的一种新技术，它用几种不同颜色的荧光素单独或混合标记的探针进行原位杂交，能同时检测多个靶位，各靶位在荧光显微镜下和照片上的颜色不同，呈现多种色彩，因而被称为多彩色荧光原位杂交。
而且多彩色荧光原位杂交技术克服了FISH技术的局限，能同时检测多个基因，在检测遗传物质的突变和染色体上基因定位等方面得到了广泛的应用(杨明杰等1998)。
4、原位PCR原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR技术的有机结合，即通过PCR技术对靶核酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使其拷贝数增加，然后通过原位杂交技术进行检测，从而对靶核酸序列进行定性、定位和定量分析。
原位PCR技术大大提高了原位杂交技术的灵敏度和专一性，可用于低拷贝甚至单拷贝的基因定位，为原位杂交技术的发展提供了更广阔的发展前景。
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